|
|
Využití metody phage display při zkoumání povrchových antigenů Leishmania mexicana
Krylová, Anna ; Spitzová, Tatiana (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Leishmania je jednobuněčný parazit obratlovců přenášený krevsajícím hmyzem - flebotomy. U člověka způsobuje onemocnění zvané leishmanióza, které se řadí mezi nejzávažnější opomíjené tropické nemoci. V části životního cyklu leishmanie probíhající ve flebotomovi je z hlediska úspěšnosti vývoje parazita klíčový moment, kdy se bičíkatá stádia (promastigoti) přichycují na epitel mesenteronu flebotoma. U většiny druhů leishmanií není známo, na který receptor flebotoma se vážou, ani které povrchové antigeny k tomu využívají. Pomocí metody phage display byly hledány peptidové ligandy promastigotů Leishmania mexicana, které mohou hrát v této vazbě roli. Inkubací fágů s promastigoty a selekcí navázaných klonů fágů bylo identifikováno 16 unikátních peptidů. Fluorescenční značení fágů zobrazujících vybrané peptidy naznačilo potenciální místa jejich vazby na receptory leishmanií. Na základě hypotézy, že nalezené peptidy mohou představovat části domnělých receptorů mesenteronu flebotoma, byly provedeny experimenty, kde byli flebotomové infikováni promastigoty, jejichž vazebná místa byla zablokovaná navázanými fágy zobrazujícími dva vybrané peptidy. Intenzita infekce se lišila mezi oběma skupinami infikovaných flebotomů. Nebyla však pozorována statisticky významná odlišnost od kontrolní skupiny. Nepovedlo se sice popsat...
|
|
|
Hledaní nových interakčních partnerů SH3 domény adaptorového proteinu p130Cas
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Protein p130Cas patří mezi hlavní tyrosin-fosforylované proteiny v buňkách transformovaných onkogeny v-crk a v-src. Jeho exprese je nezbytná pro invazivitu a tvorbu metastází v buňkách transformovaných aktivovanou kinázou Src. Vysoké hladiny exprese proteinu p130Cas u pacientů s rakovinou prsu jsou spojeny s větším rizikem návratu choroby, slabou odpovědí na léčbu tamoxifenem a horší prognózou. V netransformovaných buňkách je p130Cas fosforylován v substrátové doméně po stimulaci integrinů, což ovlivňuje buněčnou migraci a dynamiku cytoskeletu. Na této signalizaci se nepostradatelně podílí právě SH3 doména p130Cas. V této diplomové práci jsme jako první analyzovali pomocí metody Phage display a následně charakterizovali vazebný motiv SH3 domény p130Cas. Na základě tohoto vysokoafinitního motivu [AP]P[APMS]-K-P-[LPST]-[LR]-[LPST] jsme predikovali nové interakční partnery proteinu p130Cas a následně potvrdili interakci se Ser/Thr kinázou PKN3. Tato kináza kolokalizuje s p130Cas v jádře a perinukleární oblasti a mohla by p130Cas fosforylovat. V rámci této diplomové práce jsme také analyzovali vliv fosfomimikující mutace tyrosinu ze sekvence ALYD, která je konzervovaná v sekvenci SH3 domén, na schopnost těchto domén vázat ligandy. Tato mutace snižovala vazbu asi o 3 řády jak k ligandům I. třídy (SH3...
|
|
|
Development of nanochemical tools targeting receptors in the tumor microenvironment
Blažková, Kristýna ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Abramson, Jakub (oponent) ; Bušek, Petr (oponent)
Vývoj nanochemických nástrojů cílících receptory nádorového mikroprostředí Cílení receptorů nádorového mikroprostředí je zásadním krokem ve vývoji cílených terapií, personalizované medicíny a imunoterapií rakoviny. Dostupné možnosti jsou ale omezené malou dostupností cílících ligandů. Vývoj nových terapií v uplynulých letech do velké míry spoléhal na protilátky či dokonce genetické modifikace imunitních buněk. Dostupnost malých molekul cílících receptory v nádorovém mikroprostředí by umožnila rozvoj alternativních strategií léčby a diagnostiky a prohloubila by naše poznání mechanismů a zákonitostí vývoje a léčby rakovinných onemocnění. Jako vhodné cíle byly vybrány membránový antigen specifický pro prostatu (PSMA) a heterodimery CD3εγ a CD3εδ spolupracující s T-buněčným receptorem. Metodou zvolenou pro hledání nových ligandů byl inovativní fágový displej využívající chemicky modifikovaných bicyklických peptidů. Fágový displej knihovny A proti PSMA odhalil reproducibilní selekci konkrétní aminokyselinové sekvence. Fágový klon kódující tuto sekvenci specificky vázal PSMA, avšak nasyntetizovaný peptid neměl dostatečnou selektivitu ani afinitu k PSMA. Kombinací tohoto peptidového ligandu s polymerním nosičem zvaným iBody bylo ovšem možné dosáhnout zlepšení afinity vazby PSMA o tři řády, a tím i zlepšení...
|
|
|
Využití metody phage display při zkoumání povrchových antigenů Leishmania mexicana
Krylová, Anna ; Spitzová, Tatiana (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Leishmania je jednobuněčný parazit obratlovců přenášený krevsajícím hmyzem - flebotomy. U člověka způsobuje onemocnění zvané leishmanióza, které se řadí mezi nejzávažnější opomíjené tropické nemoci. V části životního cyklu leishmanie probíhající ve flebotomovi je z hlediska úspěšnosti vývoje parazita klíčový moment, kdy se bičíkatá stádia (promastigoti) přichycují na epitel mesenteronu flebotoma. U většiny druhů leishmanií není známo, na který receptor flebotoma se vážou, ani které povrchové antigeny k tomu využívají. Pomocí metody phage display byly hledány peptidové ligandy promastigotů Leishmania mexicana, které mohou hrát v této vazbě roli. Inkubací fágů s promastigoty a selekcí navázaných klonů fágů bylo identifikováno 16 unikátních peptidů. Fluorescenční značení fágů zobrazujících vybrané peptidy naznačilo potenciální místa jejich vazby na receptory leishmanií. Na základě hypotézy, že nalezené peptidy mohou představovat části domnělých receptorů mesenteronu flebotoma, byly provedeny experimenty, kde byli flebotomové infikováni promastigoty, jejichž vazebná místa byla zablokovaná navázanými fágy zobrazujícími dva vybrané peptidy. Intenzita infekce se lišila mezi oběma skupinami infikovaných flebotomů. Nebyla však pozorována statisticky významná odlišnost od kontrolní skupiny. Nepovedlo se sice popsat...
|
|
|
Selection approaches in directed evolution of binding proteins
Huličiak, Maroš ; Malý, Petr (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Umelo vytvárané väzobné proteíny odvodené od malých proteínových domén lákajú čoraz väčšiu pozornosť ako alternatívy k monoklonálnym protilátkam a majú široké spektrum využitia. Svoju aplikáciu si našli v oblastiach diagnostiky rôznych onemocnení, sú prísľubom pre vývoj vakcín proti globálnym ochoreniam ako je AIDS, môžu mať terapeutický potenciál a skvalitňujú purifikačné a chromatografické metódy. Na selekciu proteínových variánt, ktoré majú najlepšie väzobné vlastnosti sa v súčasnosti využíva viac než desať selekčných, tzv. displejových techník. Displejové techniky využívajú rôzne vektory pre vystavovanie proteínových variánt ako je tomu napríklad u fágového, kvasinkového, retrovirálneho či bakulovirálneho displeja. Selekcia taktiež môže prebiehať in vitro. Príkladom je ribozomálny displej, mRNA displej a CIS displej. Evolúcia displejových selekčných techník umožnila selekciu postranslačne glykosylovaných, fosforylovaných či acylovaných proteínov, prispela k zvyšovaniu výťažku selektovaných ligandov a k skvalitneniu ich väzobných vlastností. Práca popisuje a porovnáva vybrané selekčné metódy, pojednáva o výhodách a limitáciach ich kombinatoriálnych knižníc peptidov a uvádza praktické využitie väzobných proteínov odvodených od malých proteínových domén.
|
|
|
Hledaní nových interakčních partnerů SH3 domény adaptorového proteinu p130Cas
Gemperle, Jakub ; Rösel, Daniel (vedoucí práce) ; Forstová, Jitka (oponent)
Protein p130Cas patří mezi hlavní tyrosin-fosforylované proteiny v buňkách transformovaných onkogeny v-crk a v-src. Jeho exprese je nezbytná pro invazivitu a tvorbu metastází v buňkách transformovaných aktivovanou kinázou Src. Vysoké hladiny exprese proteinu p130Cas u pacientů s rakovinou prsu jsou spojeny s větším rizikem návratu choroby, slabou odpovědí na léčbu tamoxifenem a horší prognózou. V netransformovaných buňkách je p130Cas fosforylován v substrátové doméně po stimulaci integrinů, což ovlivňuje buněčnou migraci a dynamiku cytoskeletu. Na této signalizaci se nepostradatelně podílí právě SH3 doména p130Cas. V této diplomové práci jsme jako první analyzovali pomocí metody Phage display a následně charakterizovali vazebný motiv SH3 domény p130Cas. Na základě tohoto vysokoafinitního motivu [AP]P[APMS]-K-P-[LPST]-[LR]-[LPST] jsme predikovali nové interakční partnery proteinu p130Cas a následně potvrdili interakci se Ser/Thr kinázou PKN3. Tato kináza kolokalizuje s p130Cas v jádře a perinukleární oblasti a mohla by p130Cas fosforylovat. V rámci této diplomové práce jsme také analyzovali vliv fosfomimikující mutace tyrosinu ze sekvence ALYD, která je konzervovaná v sekvenci SH3 domén, na schopnost těchto domén vázat ligandy. Tato mutace snižovala vazbu asi o 3 řády jak k ligandům I. třídy (SH3...
|
host ::
RSS.